Nature︱线粒体移植新策略：MitoCatch精准递送拯救退变细胞

线粒体作为细胞的能量工厂，其功能异常与神经退行性疾病（如帕金森病、Leber遗传性视神经病变）、视神经萎缩、心力衰竭、缺血再灌注损伤等病理过程密切相关。尽管此前已有研究提出将健康线粒体移植至受损细胞以恢复其功能作为一种潜在的治疗策略，并在体外和体内实验中取得了一定成效，但现有方法普遍存在递送效率低、缺乏细胞类型特异性的问题，难以精准作用于病变细胞，从而限制了治疗效果并可能引发非靶向副作用【1】。某些病毒通过利用其病毒衣壳蛋白与细胞表面蛋白结合，来实现细胞类型靶向的进入。通过使用工程化或天然存在的结合子对病毒或细胞表面进行人工修饰，病毒可以被靶向至特定的细胞类型【2】。受此启发，近日，来自瑞士巴塞尔分子与临床眼科研究所的Botond Roska团队在Nature杂志在线发表题为Cell-type-targeted mitochondrial transplantation rescues cell degeneration的文章，开发了名为MitoCatch的线粒体靶向移植系统，通过将蛋白结合子展示在靶细胞表面、线粒体表面或使用双特异性结合子，实现了线粒体向特定细胞类型（如神经元、心肌细胞、免疫细胞等）的高效、精准递送。移植的线粒体可被内化、暴露于胞质并参与融合与分裂，在Leber遗传性视神经病变患者神经元及小鼠神经损伤模型中显著促进细胞存活。该研究不仅解决了现有线粒体移植技术缺乏靶向性的瓶颈，也为治疗与线粒体功能障碍相关的多种器官疾病提供一种全新的、细胞类型特异的策略。

本文研究人员开发了一种细胞类型特异性的线粒体靶向系统——MitoCatch，该系统通过蛋白结合子将线粒体与细胞表面连接起来，并将线粒体递送入靶细胞。设计了三种互补的策略，以实现MitoCatch最广泛的应用。第一种策略（MitoCatch-C）是在特定类型细胞的表面展示结合子，这些结合子进而能与线粒体表面的蛋白相互作用。第二种策略是在线粒体表面展示结合子（MitoCatch-M），这些结合子选择性地结合给定细胞类型的特定膜蛋白。第三种策略使用双特异性结合子（MitoCatch-Bi），将细胞类型特异性的膜蛋白与线粒体外膜蛋白连接起来（图1）。

对于MitoCatch-C策略，研究人员通过将抗GFP纳米抗体与OLLAS标签及PDGFRβ跨膜结构域融合，使其锚定在HEK293T细胞表面，同时将GFP定向展示在线粒体外膜（mito-GFP）。差速离心分离出的mito-GFP经纯度、完整性和呼吸活性验证后，加入表达表面纳米抗体的细胞中。结果显示，表达抗GFP纳米抗体的细胞中GFP荧光强度比阴性细胞高1300%，94.5%的阳性细胞被标记，而对照纳米抗体仅标记10.5%。在诱导人神经元（iHNeurons）中，91%的抗GFP纳米抗体阳性神经元呈GFP阳性，对照仅为11%。结合共定位和蛋白质组学分析，结果表明，通过MitoCatch-C策略，可以选择性、高效地将线粒体靶向递送至体外培养的人类细胞中。与此同时，研究结果证实，MitoCatch-C策略递送的线粒体不仅被靶细胞内化，而且能够保持完整结构、运动能力以及与细胞内其他细胞器相互作用的功能。此外，利用去稳定化抗GFP纳米抗体（dGBP1）-TagBFP融合蛋白（该蛋白仅在结合GFP时才被稳定而产生蓝色荧光）实验也证实，相当一部分移植线粒体在经内吞进入细胞后能逃避囊泡，使其外膜暴露于胞质中。更重要的是，将表达抗GFP纳米抗体或对照纳米抗体的构建体展示在离体培养的人死后视网膜组织细胞表面，然后注射mito-GFP，研究人员发现抗GFP纳米抗体阳性细胞中GFP阳性比例显著高于对照组（特异性为0.7），且移植的线粒体可在活细胞中移动。这些数据表明，基于MitoCatch-C策略的MitoCatch系统不仅适用于体外培养的细胞系和原代细胞，也能够在复杂的人类离体视网膜组织中对特定细胞类型进行有效的线粒体靶向递送。

接下来，研究人员通过在线粒体表面上展示蛋白质结合子（MitoCatch-M）来测试线粒体移植。研究人员首先将抗GFP或抗mCherry纳米抗体通过OMP25融合蛋白锚定在线粒体外膜表面，然后把这些工程化线粒体分别移植到表面表达对应抗原的细胞，阳性标记率显著高于对照。为验证完整线粒体而非片段被递送，研究人员同时用dsRed2标记线粒体基质、GFP标记外膜，在HUVECs中检测到双信号共定位，证实完整线粒体的内化；移植后6小时即可脱离内体并远离溶酶体，且未引起溶酶体酸化改变。进一步实验表明，展示抗GFP纳米抗体的线粒体在HUVECs中可存活至少4天，并形成管状网络结构，与宿主细胞线粒体网络发生功能性相互作用。为靶向天然细胞表面蛋白，研究人员开发了高亲和力抗人CD71纳米抗体，能将线粒体特异性递送至CD71+ HEK293T细胞和天然表达CD71的原代人心脏细胞，与对照纳米抗体相比实现了显著的线粒体富集。针对T细胞，研究人员利用CD71在活化后上调的特性，将抗CD71纳米抗体展示线粒体递送至活化的人CD8+ T细胞，虽然效率相对较低，但这与CD71表面丰度较低有关。此外，针对视网膜光感受器特异性标志物CD73开发的纳米抗体，能在人视网膜类器官中实现光感受器层特异性线粒体富集。值得一提的是，免疫原性评估显示，将展示纳米抗体的线粒体注射到小鼠眼、脑或血液后，未检测到针对线粒体蛋白或纳米抗体的抗体反应，表明该策略不会引发显著免疫反应。

进一步地，研究人员通过提高结合分子的亲和力来优化MitoCatch-M策略下线粒体靶向递送效率，实验结果证实，更高的结合分子亲和力可以改善靶向效率，使线粒体在更低剂量下实现有效递送。为拓展MitoCatch系统的适用性，研究人员探索了除纳米抗体外的其他类型结合分子用于线粒体靶向递送，实验结果表明，MitoCatch系统可兼容DARPins和全长抗体等多种结合子类型，实现对不同细胞类型的线粒体靶向递送。此外，研究人员利用原子力显微镜（AFM）量化了单个线粒体与靶细胞之间的粘附力，结果证实，结合子介导的特异性识别显著增强了线粒体与靶细胞之间的粘附力及多次解离事件发生率；靶抗原的存在直接决定了粘附强度，展示抗mCD71纳米抗体的线粒体仅在与mCD71阳性细胞作用时表现出高粘附力。同时，研究人员还发现，硫酸乙酰肝素（HS）虽可介导非特异性粘附，但通过HS预处理线粒体可有效阻断该非特异性相互作用而不影响结合子-受体特异性识别，从而使CD71+ T细胞的靶向特异性显著提升，为优化MitoCatch系统的递送特异性提供了可行策略。

最后，研究人员开发了第三种策略——MitoCatch-Bi，即使用双特异性蛋白结合子，一端结合线粒体外膜蛋白，另一端结合靶细胞表面蛋白。通过在体外培养细胞、小鼠视网膜神经节细胞及原代人CD4+ T细胞等多种模型中验证，该方法的线粒体递送效率远高于前两种策略，且特异性高达0.95，并能灵活选择线粒体或细胞表面的不同靶点（如TOMM20、CD71、CD4），靶向天然表达蛋白时双特异性结合分子可将靶向效率提升超过30倍。研究结果证实，MitoCatch-Bi通过双特异性结合子连接线粒体和靶细胞表面蛋白，无需对靶细胞或线粒体进行遗传修饰，为体内应用提供了更灵活的方案。

那么，将健康的人线粒体靶向患有原发性线粒体疾病的细胞是否可以减少这些细胞的变性呢？研究人员利用携带mt11778G>A突变的Leber遗传性视神经病变（LHON）患者来源的iPS细胞系分化得到iHNeurons，在这些细胞表面展示抗GFP纳米抗体后移植mito-GFP，并进行全长单细胞RNA测序。结果显示，移植细胞中野生型ND4转录本频率显著增加，其比例与总线粒体编码转录本正相关，且核编码氧化磷酸化基因显著上调；移植细胞的基础、ATP偶联及最大呼吸水平均显著高于对照组。在半乳糖替代葡萄糖诱导退化模型中，抗GFP纳米抗体组移植健康线粒体后细胞存活率提高23.6%，对照纳米抗体、尿苷或mtDNA耗竭线粒体处理均无保护作用，表明靶向移植健康线粒体可促进原发性线粒体疾病细胞的短期存活。体外伤口愈合模型实验结果显示，靶向递送线粒体可增强内皮细胞迁移能力，促进伤口愈合，从而提升细胞功能。与此同时，研究人员利用视神经挤压（optic nerve crush, ONC）小鼠模型模拟神经元损伤，将mito-GFP靶向递送至PV阳性视网膜神经节细胞（PV-RGC），实验结果显示，移植mito-GFP使PV-RGC存活率显著提高，而mtDNA耗竭线粒体则无保护效果，表明完整的线粒体基因组对于神经保护作用至关重要。GCaMP8m钙成像显示，线粒体移植组光反应PV-RGC密度显著高于对照组，且轴突串珠样病变面积仅为缓冲液组的1/4。这些结果表明，靶向线粒体移植能够在体内促进受损神经元的功能恢复。

综上所述，本研究开发的MitoCatch系统通过三种互补策略，实现了线粒体向多种靶细胞类型的高效、精准递送。移植的功能性线粒体能够整合至宿主细胞，恢复其呼吸功能，并在体外代谢胁迫及体内神经损伤模型中显著促进细胞存活与功能维持。毫无疑问，MitoCatch为治疗与线粒体功能障碍相关的神经退行性疾病、心血管疾病等多种难治性疾病提供了全新的通用平台技术。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-026-10391-0

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